Im Jahr 1542 war der Regensburger Stadtrat zum Protestantismus übergetreten. Als südöstlichste evangelische Reichsstadt wurde Regensburg im 16. Jahrhundert zum Vorposten für die Verbreitung der lutherischen Lehre entlang der Donau nach Südosten. Erstes Zentrum des neuen Glaubens war die Neupfarrkirche am Neupfarrplatz (seit 1542). Sie ist die Mutterkirche der lutherischen Christen im südöstlichen Mitteleuropa. Daher suchten vom späten 16. Jahrhundert an Abertausende von Protestanten aus den österreichischen Gebieten auf der Flucht vor der Rekatholisierung in ihrer "Muttergemeinde" um Aufnahme an.

Die Dreieinigkeitskirche gibt ein beeindruckendes Zeugnis von der großen Anzahl der protestantischen „Exulanten“, die sich in der Zeit der Glaubenskriege des 16. und 17. Jahrhunderts in die protestantische Reichsstadt Regensburg flüchteten. Für sie erbaute die Stadt – mitten in den Wirren des Dreißigjährigen Krieges! – die Dreieinigkeitskirche. Nach Neuburg a. d. Donau handelt es sich hierbei um den ersten evangelischen Kirchenbau in Bayern.

Finanziert werden konnte dieser große Kirchenbau nur durch eine astronomisch hohe Ablösesumme von 6000 Gulden, die das benachbarte Dominikanerkloster aufbringen musste, um ihre Klosterkirche nicht mehr mit der protestantischen Gemeinde teilen zu müssen. Das wehrhafte Erscheinungsbild der Dreieinigkeitskirche mag den Zeitumständen geschuldet sein, oder auch der Tatsache, dass der Architekt Johann Carl eigentlich Festungsbaumeister war.
Adelige Glaubensflüchtlinge aber auch protestantische Gesandte am Immerwährenden Reichstag fanden im Friedhof der Dreieinigkeitskirche ihre letzte Ruhestätte, wovon prächtige Grabdenkmäler bis heute zeugen.
Vom Turm der Kirche hat man einen beeindruckenden Rundblick über die Dächer der Regensburger Altstadt. Bis 2011/12 wird die Dreieinigkeitskirche umfassend renoviert und ist nur eingeschränkt zugänglich.